中空海藻酸钙固定化白色链霉菌转化去氢表雄酮的研究
[摘要] 目的 利用生物转化方法来生产具有抗氧化和抗肿瘤活性药物羟基化去氢表雄酮。方法 利用中空海藻酸钙胶囊对白色链霉菌进行固定化，然后用此固定化菌对甾体类药物去氢表雄酮（DHEA）进行生物转化，并对固定化菌的转化条件进行优化，以期获得高产量的羟基化DHEA。结果 中空海藻酸钙胶囊制备的固定化白色链霉菌对DHEA具有转化作用，并且可以通过固定化白色链霉菌的二次转化来实现羟基化DHEA产率的提高，我们同时获得了固定化白色链霉菌的最优转化条件：对生长两天的白色链霉菌进行固定化，温度35℃，pH值7.0，转速150 r/min，转化时间3 d。结论 采用固定化白色链霉菌转化DHEA方法可行，而且此种方法具有广泛的工业应用价值。
[关键词] 中空海藻酸钙胶囊；白色链霉菌；固定化
[中图分类号] Q93 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）08-65-04
甾体类药物去氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是一种C19肾上腺甾体类药物，主要具有抗癌、延缓衰老及免疫调节等作用[1]。以其为中间体能合成更多有重要生理活性的甾体类药物，如抗氧化活性及抗肿瘤作用更显著的药物羟基化DHEA[2]。但是利用化学合成法合成羟基化DHEA成本太高，而且会产生很多副产物。因此，利用生物法对DHEA进行转化以获得药物羟基化DHEA可以有效的节约成本[3]，尤其是可进行连续发酵的固定化细胞的生物转化越来越受到人们的青睐[4]。在微生物的固定化过程中，非常有效的一种固定化材料是中空海藻酸钙胶囊。中空海藻酸钙胶囊是起源于海藻酸钙凝胶珠的一种固定化体系，是一种有广阔发展前景的新型微胶囊体系[5]。本研究以中空海藻酸钙胶囊为载体，实现了对白色链霉菌的有效固定化，而且获得的固定化细胞可用来生物转化DHEA生成药物羟基化DHEA，并对固定化白色链霉菌转化DHEA的条件进行了优化，以提高产物的转化率。
1 实验材料
1.1 菌种
白色链霉菌，由山东省微生物工程重点实验室菌种保藏中心保藏。
1.2 培养基
斜面培养基PDA（g/L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，pH自然；转化培养基PDB（g/L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然。
1.3 材料和试剂
去氢表雄酮（武汉合中生化制造有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市广成试剂有限公司）；氯仿（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；显色剂：10%硫酸-乙醇溶液；CaCl2（分析纯，天津市风船化学试剂有限公司）；海藻酸钠（化学纯，天津市大茂化学试剂厂）；羧甲基纤维素钠（化学纯，天津环宇红星食品贸易有限公司）。
1.4 实验仪器
DHZ-DA型全温摇床（江苏太仓市实验设备厂）；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SW-CJ-IB超净工作台（苏州净化设备有限公司）；ZF-2型三相紫外分析仪（上海安亭电子仪器厂）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；90-2型定时恒温磁力搅拌器（上海天平仪器厂）；J232D-Epson perfection V330 Photo 扫描仪（上海家佳乐计算机网络有限公司）。
2 实验方法
2.1 中空海藻酸钙胶囊的预制备与优化
将羧甲基纤维素钠加入到蒸馏水中加热煮沸使其溶解，然后向此溶液中加入CaCl2，将此混合液搅拌均匀作为阳离子溶液。将海藻酸钠（SA）加入到含蒸馏水的三角瓶中，加热煮沸使其完全溶解，自然降温待用。将上述制备好的阳离子溶液用注射器逐滴加入到SA溶液中，搅拌5～10 min，过滤获得胶囊。将获得的胶囊用无菌水洗净，然后再放入到1%（m/v，g/100 mL）的CaCl2溶液中继续搅拌约20 min左右，进一步固定化微胶囊的外表面。然后，再次用蒸馏水清洗以除去胶囊表面的Ca2+，最后将胶囊浸于4℃的蒸馏水中备用[6]。通过单因素实验，对SA浓度、CMC浓度、CaCl2浓度、滴加速度、搅拌时间、针头孔径、滴加高度和摇床培养时间等进行优化，确定胶囊制备的最佳条件，以获得胶囊最佳的形状和机械强度。
2.2 中空海藻酸钙固定化白色链霉菌转化DHEA的验证
胶囊的制备过程如实验方法2.1。固定化白色链霉菌时，只要将培养两天的白色链霉菌与CaCl2/CMC阳离子溶液混和均匀，然后用此溶液滴制微胶囊即可。固定化好的白色链霉菌添加到含有60 mL的液体PDA培养基中，再加入600μL的1 mg/mL的丙酮溶解的DHEA，然后放入到摇床上生物转化3 d。转化结束后，对发酵液进行乙酸乙酯萃取、旋转蒸发浓缩、TLC点板，分别在三用紫外仪（波长：253.7 nm）和显色（显色剂：硫酸：乙醇=1∶9）条件下验证白色链霉菌经过固定化之后对DHEA是否有转化活性。本实验分别以自由菌和杂菌对DHEA的转化作为阳性和阴性对照，做两组平行对照。
2.3 固定化白色链霉菌转化DHEA条件优化
主要是考察温度、pH、转速、转化时间、固定化菌的生长状态对固定化白色链霉菌转化DHEA的影响。实验过程利用单因素实验，设置不同的影响因素梯度，考察各个因素对固定化白色链霉菌转化DHEA的影响，产物7α和7β-OH-DHEA通过薄层扫描仪（TLCS）来定性定量分析[7]。
2.4 固定化白色链霉菌的重复利用
固定化白色链霉菌一次转化完成后，对发酵液进行分离，然后将固定化菌用无菌水多次洗涤，清洗完的蒸馏水跟分离得到的发酵液一起进行萃取，浓缩，TLC点板和转化率的确定。清洗完成后再将固定化菌加入到含有600μL DHEA（1 mg/mL）和60 mL PDA液体培养基的250 mL三角瓶中进行二次转化，转化3 d。以同样的方法进行3次转化。转化完成后测定各次转化对DHEA的转化率。
3 结果与分析
3.1 中空海藻酸钙胶囊的制备与优化
实验通过将CMC和CaCl2组成的阳离子溶液向SA溶液中滴加，成功完成了中空海藻酸钙胶囊的制备，获得的中空海藻酸钙胶囊如图1。
球形的胶囊有利于保持胶囊的均匀，从而有助于营养物质的均匀扩散和产物的有效排出。而一定机械强度的胶囊可以防止胶囊在摇床上培养菌时破裂，菌体外泄。通过单因素实验获得最佳的胶囊制备条件：SA浓度1%（w/v，1g/100 mL，下同）、CMC浓度1%、CaCl2浓度8%、滴加速度210滴/min、搅拌时间20 min、滴加高度8 cm、大孔径的针头。在此最优条件下胶囊的成球能力很好，直径：（10.0±1.2）mm， 内径：（8.2±0.9）mm，厚度：（0.9±0.13）mm，机械强度：（11.50±1.8）N。
3.2 中空海藻酸钙固定化白色链霉菌转化DHEA
采用3.1中制备胶囊的最佳条件，完成了对白色链霉菌菌体的固定化如图2[8]。由结果可知，充满白色链霉菌菌体的胶囊呈现黄色，不透明，这与空的中空海藻酸钙胶囊对比明显。将上述固定化胶囊加入含有60 mL液体PDA培养基的250 mL三角瓶中，再加入DHEA进行生物转化，分别在三用紫外仪和显色条件下获得的转化结果如图3。固定化白色链霉菌对DHEA具有转化作用，虽然相对于自由菌其转化率偏低，但是固定化白色链霉菌对DHEA表现出了明显的转化。因此通过白色链霉菌固定化的方法来实现DHEA的生物转化是可行的，并且可以通过条件优化和固定化菌的重复利用来实现转化率的提高[9]。
3.3 固定化白色链霉菌转化DHEA条件优化
利用单因素实验测定了温度、pH、转速、转化时间、固定化的自由菌的生长状态对固定化白色链霉菌转化DHEA的影响结果如图4。各因素对固定化白色链霉菌转化DHEA的结果影响很大。通过对各因素优化之后，固定化白色链霉菌对DHEA的转化率达到40%左右，使得其转化率有一个明显的提高。实验过程获得的最优转化条件为：对生长两天的白色链霉菌进行固定化，温度为35℃，pH为7，转速为150 r/min，转化时间为3 d。
3.4 固定化白色链霉菌的重复利用
将固定化好的白色链霉菌分别进行一次、二次和三次转化，以实现固定化白色链霉菌的重复利用，从而达到羟基化DHEA的高产率。不同的转化次数对DHEA的转化率见图5。固定化白色链霉菌对DHEA的第一次转化转化率为37%，二次转化率为50%，三次转化率为13%。固定化菌的二次转化能力较强，三次转化能力较弱。造成这种结果的原因可能是刚固定化好的白色链霉菌在胶囊内经过一个延迟过程，再加上第一次分离时，产物可能在胶囊内不能充分释放，导致一次获得的转化率低于二次转化获得的转化率。而菌体的老化以及胶囊表面附着的培养基等造成胶囊部分堵塞可能是导致三次转化率降低的原因[10]。
图5 固定化白色链霉菌的重复利用
4 讨论
近年来，甾体类药物的应用领域不断扩大，尤其是其在医药工业中的广泛应用，使其成为市场化程度较高的医药产品之一，而且甾体类药物已经是仅次于抗生素的第2大类药物[11]。在这些甾体类药物中，DHEA是很重要的一员，它可以来源丰富、价格低廉的薯蓣皂苷元为原料，经简单的化学合成法而得。此外，以其为中间体获得的羟基化DHEA可以提高肌体免疫力，具有明显的免疫调节能力，对B淋巴细胞也有显著的抑制作用。它们还可以延缓衰老，保持青春活力，增强体能，改善情绪和睡眠，提高记忆力等，因此是一种具有较大发展前景的药物[12]。利用中空海藻酸钙胶囊固定化细胞对DHEA进行生物转化来获得药物羟基化DHEA能有效的提高目标产物的转化率，并且可以实现固定化菌的重复利用，可以更好的对产物进行分离，同时还能大量的节约成本，是一种非常有潜力的生物转化方法。
本研究中，利用中空海藻酸钙胶囊对DHEA的转化菌株白色链霉菌实现了较好的固定化，并且证实固定化白色链霉菌对DHEA仍保留转化活性。而且，经过单因素实验的优化实现了固定化白色链霉菌对DHEA转化率的提高，使得固定化菌的转化率从原来的30%左右提升到41%。此外，本研究还实现了固定化菌的重复利用，固定化菌的二次转化比一次转化转化率提高了13%，说明了固定化菌的重复利用情况较好。固定化菌的重复利用不仅提高了固定化白色链霉菌的转化率，同时节省了孢子悬液的制备和固定化等过程，有效的节约了成本以及固定化菌对DHEA的转化周期。综上所述，本研究采用中空海藻酸钙胶囊固定化白色链霉菌转化DHEA是一种非常经济适用的生物转化方法，同时也为羟基化DHEA的工业生产提供了理论基础。
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（收稿日期：2013-03-15）
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