软骨组织工程支架材料研究进展
李德保 综述，章庆国 审校
[摘要]各种原因引起的关节软骨损伤在临床工作中非常常见，但临床治疗手段有限，组织工程的发展为关节软骨损伤的修复提供了新的途径。在软骨组织工程中支架材料起着重要作用，选择合适的载体是一个首先要解决的问题。本文对目前软骨组织工程支架材料的现状做一综述，指出了当前软骨组织工程所面临的问题, 并针对此问题对未来软骨组织工程材料的研究作出了展望。
[关键词]软骨；支架材料；组织工程
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0408-03
Advancement of research of scaffold in cartilage tissue engineering
LI De-bao1，ZHANG Qing-guo2
(1.Department of Plastic Surgery，Affiliated Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009 Jiangsu,China; 2.Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144,China）
Abstract: Articular cartilage defect is caused by various factors and is frequently seen in clinical field but it is limited in treatment. The evolvement of tissue engineering, a new method promises to render the repair of articular cartilage injury. Scaffold material plays important role in cartilage tissue engineering, so selection of an appropriate carrier is to be done firstly. The aim of this review is to discuss the current status of scaffolds, and problems in cartilage tissue engineering. In future, ideas are promising to solve the problems in the field of cartilage tissue engineering.
Key words: cartilage; tissue engineering; scaffold
由于创伤、骨关节炎以及骨软骨病引起的软骨畸形或缺损在临床上非常常见。软骨组织缺乏血运，软骨细胞有丝分裂活性低，自我修复能力有限，严重影响了软骨缺损的愈合，目前的治疗方法主要有微骨折术、软骨下骨钻孔术、软骨下磨削术、自体软骨移植和自体软骨细胞移植术，但是这些治疗方法都存在许多不足之处[1-2]。组织工程技术的发展为软骨再生修复提供了新的选择。组织工程[3]就是应用生命科学和工程学的原理和方法,研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门新兴学科。组织工程主要包括三方面[4]：种子细胞、支架材料和细胞因子，其中支架材料是软骨组织工程的研究热点之一，本文就软骨支架材料研究进展进行综述。
1软骨组织工程支架材料特点
支架材料为软骨组织构建提供了一个三维的环境，理想的生物支架材料应具有以下特点[5]：①有良好的组织相容性，无毒，无致畸性；②有三维立体结构：材料必须是高度多孔的，一般要求孔隙率达90%以上，为细胞黏附生长、细胞营养成分的渗入以及细胞代谢产物的排出提供有利条件；③生物可降解性和降解率：材料应是可吸收的，在组织形成过程中逐渐分解，从而不影响新形成组织的结构和功能，降解速度与组织再生的速度相匹配；④良好的细胞界面：材料应具有良好的表面活性，有利于细胞贴附，并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境；⑤具有可塑性和一定的机械强度：材料可以被加工成所需要的形状和大小，并有一定的机械强度，在体内一定时间内仍可保持自身形状，从而使新形成的组织具有一定的外形。
2软骨组织工程用材料分类
目前软骨组织工程支架材料种类繁多[6],主要可分为三类：①天然高分子支架材料，如藻酸盐、纤维素、壳聚糖、胶原、硫酸软骨素、明胶、纤维蛋白以及透明质酸等；②人工合成材料，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯、多肽、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚体(PLGA)等；③复合材料，如明胶/硫酸软骨素/透明质酸钠、聚氧化乙烯/甲壳素/壳聚糖、壳聚糖/明胶、羟基磷灰石/胶原/透明质酸等。
2.1 天然高分子支架材料：壳聚糖为甲壳类动物、昆虫以及其他无脊椎海洋动物外壳,真菌的细胞壁中的甲壳素(β-1、4聚-2-乙酰胺基-D-葡糖)脱乙醇化而制得,结构与葡萄糖胺聚糖（GAG）相似，因此可以模仿体内的环境，保进软骨细胞的生长，具有良好的生物相容性和抗菌性。壳聚糖水凝胶作为软骨支架，可诱导软骨细胞外基质生成[7]。Nettles[8]等用壳聚糖的溶液经冻干法制得立体支架，然后将猪软骨细胞植入这种壳聚糖支架上，体外培养6周，免疫组化显示有葡萄糖胺聚糖及Ⅱ型胶原生成。胶原是构成各种细胞外间质的聚合物，其中Ⅱ型胶原是软骨组织的主要成分，其突出优点是无抗原性，生物相容性好，动物体内试验表明将胶原支架填充于软骨缺损处可形成类似透明软骨，缺点是降解太快，新生组织往往达不到很好的塑形[9]。藻酸钙是一种理想的水凝胶支架材料，藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养，内部孔隙多，适合细胞黏附和营养交换。将悬浮有兔自体软骨细胞的藻酸钠和氯化钙相混合，修复自体软骨缺损，4～6个月后发现缺损区有正常的软骨组织[10]。透明质酸[11]是构成关节软骨的主要成分之一，作为支架材料，能为种子细胞的生长提供类似胚胎软骨发育的微环境。纤维蛋白凝胶是利用血液凝固的机理使纤维蛋白单体在凝血酶作用下聚合成立体网状凝胶，可为细胞生存提供良好的三维空间，也能促进Ⅱ型胶原的表达，缺点是降解速度过快[12]。纤维素是自然界中广泛存在的线性糖的聚合物，主要通过酶降解,具有良好的生物相容性。细菌纤维素是类似于天然纤维素的高分子化合物，Bodin等认为细菌纤维素，不但价格低廉，还具有高强度，可塑性好,可用于关节半月板损伤的治疗[13]。
2.2 人工合成材料：人工合成材料是一类有机高分子聚合物，具有良好的物理机械性能，通过调节分子量及其分布以适应不同需要，作为软骨组织工程支架材料能较好的诱导软骨细胞黏附、增殖和分化。聚羟基乙酸(PGA)是一种高度结晶、具有亲水性的线性聚脂体，在体内可以通过正常的代谢途径完全排出体外。聚乳酸(PLA)与聚羟基乙酸（PGA）相比，水溶性较差，降解半衰期较长，可以提供更长时间的支架作用。PLGA是聚乳酸和聚羟基乙酸按一定比例形成的共聚物，可以结合二者各自的特性，既能提供足够时间的支架作用，又有利于细胞黏附生长。Shin等学者将PLA和PGA按1:1和3:1两种不同比例混合，结果显示按1:1比例混合的材料更容易降解[14]。曹谊林等[15]将牛肋软骨细胞接种于人耳形状的PGA支架后植于裸鼠皮下, 形成了具有人耳形状的软骨组织，实验表明软骨细胞可较快地附着于PGA材料表面，PGA大约在植入3周后开始降解, 其降解速度与软骨组织的形成速度基本匹配, 新生的软骨组织保持了最初聚合物支架的形状。
2.3 复合材料：随着组织工程的发展,人们认识到单一成分构成的三维支架难以满足器官组织工程基本要求。将两种或两种以上的具有互补特性的生物材料，按一定比例和方式组合在一起，可以设计构造出能够满足不同器官组织工程的复合支架材料。将Ⅱ型胶原加入PLGA中可以增加软骨细胞增殖和胶原沉积,同时会减轻炎症反应[16]。Yoo HS等[11]将透明质酸（HA）加入PLGA中可以增加软骨细胞黏附以及GAG和胶原的合成。Hua Wu等[17]研究显示合适比例的多孔聚丙酯/壳聚糖复合支架要比单纯多孔聚丙酯支架具有更好的生物学特性,不仅能增强细胞黏附、增殖，还能促进Ⅱ型胶原的产生。Sarasam A等[18]报道壳聚糖/聚己内酯（PCL）复合支架具有较好的机械力学特性。Kuo YC等[19]研究显示聚氧化乙烯/甲壳素/壳聚糖复合支架比单一支架具有更强的生物活性和力学弹性。
3材料的表面修饰与改性
材料的性能因素主要是指材料表面的亲疏水性、电荷及化学结构，无论是天然材料，还是合成材料，在细胞亲和性和细胞黏附性上都存在种种不足。利用化学改性和等离子喷涂等[20]方法在材料上引入特殊的蛋白质、肽以及其他的生物分子，可以模拟出细胞外基质环境，形成一个多功能的细胞黏附表面，会使材料的细胞亲和力和细胞黏附力增强[21]。Dee等[22]在支架上整和上一段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸多肽链，可以促进细胞的黏附与生长，多聚赖氨酸（PLL）包埋细胞支架也取得同样效果。胶原仿生肽（CMP）是一种由特殊氨基酸序列组成的物质,与Ⅰ型胶原分泌有关，Lee及其同事将CMP交联到聚乙二醇(PEG)水凝胶上，免疫组化显示细胞外基质（ECM）分泌明显增加[23]。
4多孔聚合物支架的制备方法
多孔聚合物支架的孔径大小根据制作工艺的不同而不同，一般为10～200μm。支架的孔与孔之间可相互连接，细胞可深入支架内部生长,而孔隙率及孔尺寸取决于支架制备方法。目前多孔聚合物材料的制备方法主要有纤维粘接法、粒子致孔法、气体发泡法和相分离法等[24-27]。纤维粘接法是将不相连的PGA纤维编织成三维连通的纤维网，Mikos等[24]将PGA纤维浸到PLLA的氯仿溶液中待溶液挥发后，PGA纤维网嵌入到PLLA中形成复合物，随后加热，PLLA因熔点低而先充满PGA纤维网中，最后经过热处理，选用只能溶解PLLA的溶剂将其溶解，就可得到多孔支架，这种方法得到的多孔支架强度较低，有机溶剂会有残留，易导致种植细胞损伤。粒子致孔法是将材料和致孔剂粒子充分混合，然后利用二者不同的溶解性或挥发性，将致孔剂粒子除去而得到多孔材料，其优点是能得到预先设计的孔径及孔隙率。气体发泡法采用气体作为致孔剂，在制孔过程中不使用有机溶剂，形成多孔泡沫结构，孔径约100μm，孔隙率达93%，优点是不需滤除过程，但形成气孔在多数是非连通的。Harris等[25]将气体发泡技术和致孔剂沥滤技术相结合制备了PLGA多孔支架。相分离法包括乳化/冷冻干燥和热相分离法。乳化/冷冻干燥[26]是利用深度冷冻使溶剂真空升华的原理制备多孔材料的一种技术，支架的孔形态、机械性能、生物活性可由溶液中的不同聚合物浓度，淬火温度等控制。热液相分离主要是利用热力动力学原理，在聚合物溶液中形成了富含聚合物和聚合物贫乏的两相，去除聚合物贫乏相可形成高渗透多孔网状聚合物。控制相分离的条件,可以控制所得聚合物材料的密度、孔径大小以及孔的形态等，但实现难度较大。Blaker等[27]利用热致相分离得到具有敞开、互连、规则孔结构的骨支架材料。
目前兴起的电子编织技术和生物打印技术为构建精细三维支架提供了可能[28]。就目前的情况而言，最好是选择适当的方法将几种材料组合成复合材料，取长补短，模拟天然软骨基质组成成分，负载各种有利软骨细胞生长、增殖和分泌基质的细胞因子，结合计算机辅助设计和三维打印快速成形技术，将生物可降解材料预制加工成精确形状(如耳廓、气管、鼻假体等)，通过降解速率较慢的内支撑支架，维持材料支架的精确外形，研发具有一定机械强度、适当孔径和精确外观形状的可降解生物支架材料。
5问题与展望
随着生物技术、材料学以及计算机的迅猛发展，关于软骨组织工程支架材料的研究也取得很大进展。目前实验中的软骨支架材料,无论是天然的,还是人工合成的，都存在一定的缺陷，例如体内吸收过快或过慢，生物相容性问题，支架表面结构也影响细胞的黏附和生长。软骨缺损多数形状不规则，虽然注射式材料可以用于修复这类不规则缺损，但其机械性能方面较差，难以满足临床要求。此外，支架的降解速度对骨软骨缺损修复进程也是很关键的，溶解慢的支架可以在其表面维持较厚的软骨，起到很好的塑形作用，但是会影响营养物质的扩散，在这些软骨表面会出现裂缝以及“空心”现象等[29]。迄今为止，尚未找到一种完全理想的软骨支架，因此，一方面需要进一步努力探寻具有良好的生物相容性、生物可降解性、无免疫原性、良好的可塑性的软骨支架材料；另一方面可对现有的软骨支架材料进行表面修饰改性，促进其吸附软骨细胞，分泌蛋白多糖和胶原基质等，为软骨细胞生长提供一个良好的微环境。相信不远的将来，会有更加理想的软骨支架材料研制成功，为组织工程软骨的早日临床应用打下重要的基础。
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[收稿日期]2008-12-25[修回日期]2009-02-10
编辑/张惠娟
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